精密発酵の産業株構築における課題と解決戦略―多様化と選抜の営みによる最適化手法

本稿は、株式会社シーエムシー出版の書籍『発酵工業の最新動向』に寄稿した原稿を、許可を得て転載したものです。

河合哲志 ／ バイオ生産本部 本部長
尾島匠 ／ Senior BioEngineer

1.1　はじめに

　近年、ゲノム編集技術や合成生物学を活用し、微生物の代謝経路を遺伝子レベルで合理的に設計することで、特定のタンパク質や脂質、香料、甘味料、色素などの機能性化合物を効率的かつ高精度に生産させる取り組みが急速に発展しており、この取り組みは「精密発酵」と呼ばれている^1,2)。「精密発酵」では、従来の発酵では生産できなかった多様な化合物を生産対象とすることが可能であり、昨今の持続可能なものづくりへの要求の高まりも相まって注目されている。その中核課題は、目的物質の高い生産性と産業適合性を両立する菌株の構築にあり、本節ではその技術的枠組みについて概説する。

1.2　精密発酵における演繹的設計の基本思想

　精密発酵における菌株開発は、近年のゲノム解析や各種オミクス解析の進展により、代謝に関与する遺伝子・酵素・代謝反応情報が網羅的に取得可能となったことを背景として、「目的とする代謝機能はゲノムレベルで合理的に設計可能である」という前提に基づき体系化されつつある。すなわち、どの遺伝子がどの酵素をコードし、その酵素がどの代謝反応を担い、結果としてどのような代謝経路が形成されるか、という対応関係がデータとして記述可能となったことで、目的物質に至る代謝経路を設計対象として扱うことが可能となったという考え方である³⁾。このような前提のもと、菌株開発は、既知の生化学反応および遺伝子情報を組み合わせることで目的物質の合成経路を設計し、その経路を構成する酵素遺伝子と発現量を決定すれば、所望の代謝フラックスを実現できると捉えられる^4-6)。すなわち、代謝経路は構成要素（酵素反応）とその量（発現量）の組み合わせとして定式化でき、その最適化問題として解くことができるという発想である。
　この設計思想は、データベースおよび計算機シミュレーションを基盤とした代謝経路設計（Design）を起点に、設計した代謝経路を宿主に実装（Build）し、構築した菌株の培養およびオミクス評価（Test）の結果を機械学習などに供する（Learn）DBTL サイクルとして実行される⁷⁾。Learnは、設計モデルと実測値の乖離を補正し、より精度の高い設計へと収束させるための工程として位置づけられる。
　このように精密発酵における菌株開発は、「遺伝子-酵素-代謝反応」の対応関係が十分に記述できれば、目的とする代謝経路およびフラックスは設計可能であるという演繹的な設計思想に依拠している。 

1.3　菌株開発における演繹的アプローチの限界とその要因 

　前項で述べたような設計思想は一見合理的であるが、実際の菌株開発においてはこのような解析的・演繹的アプローチのみで高生産性を実現できるケースはむしろ限定的である。その根本的な理由は「設計対象である細胞が、構成要素の単純な総和として振る舞わない」点にある。
　まず、導入する酵素機能の予測精度には不確実性がある。代謝設計では、各反応を担う酵素が既知の触媒能を発揮することを前提としているが、実際には酵素活性は生体内の環境に強く依存する。データベース上では同一の化学反応を触媒する酵素であっても、その由来生物によって酵素活性（k_cat/K_m）、基質特異性、金属イオン要求性、補酵素特異性（NADH/NADPH など）さらには至適 pH、温度といった性質が大きく異なる。加えて、実際の宿主内における酵素機能は、単純な触媒能にとどまらず、発現量、タンパク質のフォールディング効率、補因子供給、さらには細胞内局在などにも依存する⁸⁾。また、これらの生化学的特性の多くは in vitro で取得されたデータであり、細胞内環境（in vivo）を必ずしも反映していない^9,10)。このため、データベース情報に基づくシミュレーションのみでは導入する酵素の宿主内における酵素活性や代謝フラックスへの寄与を正確に予測することは困難である。
　また、代謝ネットワークの多層的かつ動的制御の影響もある。一例として代謝経路は転写因子などを介した遺伝子発現制御の強い影響を受ける。すなわち、特定の代謝産物やエネルギー状態（ATP/ADP 比、NAD(P)H/NAD(P)^＋ 比など）に応答して転写因子が活性化・抑制され、関連する酵素群の発現量が動的に変化する^11-14)。さらに、酵素活性そのものもフィードバック阻害やアロステリック制御を通じて非線形的に制御される¹²⁾。このように、代謝は単なる化学反応の連結ではなく、多層的かつ動的な制御機構により調節されているために、個々の代謝反応を独立に最適化しても代謝経路全体のフラックスが予測通りに増加するとは限らない。むしろ、特定代謝物の蓄積による反応阻害や、補因子の枯渇による全体的な反応停止など、設計時には想定されないボトルネックが顕在化することが多い。
　設計した代謝経路中に明快なボトルネック反応がある場合、酵素活性の改善に寄与するアミノ酸変異を予測するが、この予測精度には限界がある。一般的に酵素のアミノ酸変異予測は、配列情報または構造情報に基づいて予測される。まず配列情報に基づく予測では、有用変異の予測精度は入力するホモログ配列のデータ量に加え、それらの進化的多様性に依存する¹⁵⁾。自然界の酵素配列には進化の過程で蓄積された多数の中性変異が含まれており、これらは変異予測におけるノイズとして作用するため¹⁶⁾、高精度な予測にはノイズの影響を相対的に低減できる十分な配列数が必要となる。しかし、例えば、特定の生物種のみが有する酵素のように配列多様性が限定的な場合には、この条件を満たすことが難しく予測精度の制約となる。また、構造情報に基づく手法にも課題がある。酵素は動的構造をとる触媒であるにも関わらず¹⁷⁾、結晶構造や予測構造はあくまで動的構造におけるスナップショットに過ぎない。そのため、遷移状態などの酵素反応における重要な構造が十分に反映されておらず、このことが有用変異の予測精度の低下につながる¹⁸⁾。
　これらの課題を改善するために、菌株開発では設計精度を漸進的に向上させる枠組みとして DBTL サイクルが用いられている。 DBTL サイクルが想定通りに機能する場合には、前述のように初期の設計が不完全であったとしても、実験データに基づいて DBTL サイクルを繰り返すことでモデルは逐次改善され、最終的には目的とする性能に収束することが期待される。しかし実際には、このような期待通りに設計精度が向上しないケースが多く報告されている。その要因の一つは、 DBTL サイクルにおける「学習データの質と情報量の制約」にある。
　DBTL サイクルにおける Learn が有効に機能するためには、設計変数（遺伝子発現量、酵素の組み合わせなど）と出力（代謝フラックスや目的物質収量）との間に、十分に解釈可能かつ再現性のある対応関係が存在し、それを学習可能なデータとして取得できることが前提となる。しかし、実際の細胞内代謝は前述のような多数の潜在変数に依存する多次元かつ非線形なシステムであり、オミクス解析によって取得されるデータはその一部を間接的に観測したものにすぎない。例えばメタボローム解析で測定される代謝物濃度は、導入された代謝経路の影響のみを反映するものではなく、前述のような代謝ネットワーク全体の動的制御の影響を強く受ける¹⁹⁾。このため、測定された代謝物濃度の変化が設計した代謝経路の改変に起因するものか、あるいは代謝ネットワーク全体の応答によるものかを切り分けることは容易ではない。このような結果として、オミクスデータの変化と代謝表現型との間の相関はしばしば弱い、あるいは条件依存的となるため、汎用的な予測モデルの構築が困難となる。
　この問題をデータ量によって補完することも容易ではない。高品質なオミクスデータの取得にはコストおよび時間の制約が大きく、実験的に探索可能な設計空間は限定される。そのため、機械学習的アプローチを適用する場合であっても、高精度な予測モデルの構築のために一般に必要とされる規模の学習データを確保することが難しく、モデルの外挿性能の低下といった問題が生じやすい。
　このように、 DBTL サイクルはサイクルは形式的には演繹的設計の不完全性を補う枠組みであるものの、その中核である Learn 工程が依拠するデータ自体が、代謝システムの複雑性に対して十分なデータを提供していないために、モデルの更新が限定的なものにとどまり、結果として設計精度が頭打ちとなる。
　これらの課題は、代謝経路設計において各要素の特性を記述することで全体の挙動を予測・設計する、つまり解析的に代謝系の挙動を理解することを前提とした演繹的アプローチの限界を示している。精密発酵における商業生産を見据えた高い生産性を有する菌株の開発では、演繹的設計を活用しつつ、代謝系の複雑性を解き明かすことなく工学する、すなわち実験探索に基づく帰納的な最適化手法を組み合わせることが不可欠である（表1）。

 表1　演繹的アプローチおよび帰納的アプローチの特徴比較

1.4　帰納的アプローチによる菌株開発手法について

　帰納的アプローチは、多様性の創出と選抜を繰り返すことで最適化を図る戦略であり、菌株開発においては演繹的設計の限界を突破する必須の方法論である。本項では、宿主選定や代謝経路設計といった菌株開発における各工程について、帰納的観点から整理する。
　宿主選定は菌株開発において最も上流に位置する工程であるが、単なる微生物種の選択ではなく、目的物質の生産から回収・精製に至るまでのプロセス全体を見据えた全体戦略に基づいて行われるべきものである。すなわち、まず対象とする物質の物性（揮発性、疎水性、細胞内蓄積、毒性、析出性など）や用途に応じて、想定される回収・精製プロセス（培地中への分泌回収、細胞破砕抽出など）を含む生産プロセスの全体像を設計し、その要件に適合する宿主を選定するというアプローチが重要となる。例えば、疎水性化合物の生産においては、細胞外への分泌性や有機溶媒耐性といった、プロセスと密接に関わる表現型が重要な選定指標となる。加えて、精密発酵では宿主が元々生産することがないアイテムを生産することがほとんどであることから、遺伝子操作性やゲノム情報の整備といった代謝工学的観点も重要な前提条件となる。これらを満たす複数の宿主候補を対象として、上記のプロセス適合性を実験的に評価し、比較検討により適した宿主を選抜する。また、最終用途が食品や化粧品用途である場合には、安全性や規制適合性、消費者需要性といった非技術的要件も初期段階から織り込む必要がある。
　代謝経路の構築においては、 ATLAS of Biochemistry²⁰⁾ や OptFlux²¹⁾ などを活用したシミュレーション結果に基づく化学両論上効率的な代謝経路設計を出発点としつつも、各反応を担う酵素遺伝子については宿主における酵素活性の予測が難しいことから実験的に最適化する。具体的には、各酵素について配列相同性などを指標に多様性を持たせた異種由来酵素遺伝子をライブラリとして準備し、宿主内で発現させたうえで目的物質および代謝中間体の生産量を指標に実験的に評価・選抜する。また、発現させる遺伝子の多様化とともに、プロモーターや 5′UTR および 3′UTR も同時にライブラリ化することで遺伝子発現量の多様性を創出し、組み合わせ最適化を実施する。特に多遺伝子経路では、単一遺伝子の最適化ではなく、構築する代謝経路全体のフラックスを考慮した最適化が必要である。一部の原核生物ではプロモーターや 5′UTR および 3′UTR の配列ライブラリが整備されている他^22,23)、 5′UTR については翻訳開始効率に多様性を持たせた 5′UTR ライブラリを設計することも可能である²⁴⁾。
　しかし、宿主候補の中にはこのような配列ライブラリが十分整備されていない宿主も多く、前述の最適化手法の適用が困難である。このような課題に対し、近年の解析技術の進展により新たなアプローチが提案されている。その一例がポリソーム解析である。ポリソームは1本の mRNA に複数のリボソームが数珠状に結合した翻訳中間体であり、この画分を分離・解析することで、各 mRNA の翻訳効率を反映した情報を取得することができる²⁵⁾。トランスクリプトーム解析が mRNA 量を指標とするのに対し、ポリソーム解析は翻訳段階の遺伝子発現量を直接的に評価可能である点に特徴がある。さらに、ポリソーム画分を回収して次世代シーケンシングと組み合わせることで、翻訳効率の高い配列特徴を網羅的に抽出する試みも報告されている²⁶⁾。これは、発現制御配列を事前に設計するのではなく、実測データから有効な配列特徴を帰納法的に抽出するアプローチである。このような手法を活用することで、従来配列ライブラリが整備されていなかった生物種でも遺伝子発現量の多様化が可能となることが期待される。
　酵素活性を実験的に改良する手法として指向性進化が広く用いられている。指向性進化は酵素遺伝子へのランダムな変異導入による酵素配列の多様化と、活性が向上した酵素変異体の選抜を繰り返す手法であり、酵素の構造や作用機序の詳細が不明な場合でも適用可能である。代表例として Frances H. Arnold らによるサブチリシンEの有機溶媒耐性改良が挙げられ²⁷⁾、この成果を契機として本手法は産業酵素開発に広く応用されてきた。指向性進化では、エラープローン PCR によって酵素遺伝子に in vitro で変異を導入し、得られた遺伝子ライブラリを個別に宿主に導入して in vivo で活性評価を行う手法が主流である。ただし、ライブラリサイズは宿主の形質転換効率に制約され、大腸菌の場合で 10⁶〜10⁷ 程度となる。近年では、in silico 解析により重要なアミノ酸残基を絞り込み、当該部分に対して飽和変異を導入する半合理的指向性進化も広く用いられている²⁸⁾。また、指向性進化によって獲得した変異体の機能特性とアミノ酸変異を学習させ、活性改善に寄与する可能性が高い配列を選択することで、指向性進化を加速させる取り組みも行われている^29,30)。
　目的物質の高生産株を構築するためには、導入した代謝経路のみならず、宿主内在代謝経路全体を最適化する必要がある。外来代謝経路と宿主内在代謝経路の間では前駆体や補因子を巡る競合が生じやすく、これが代謝フラックスの分断や生育阻害、生産性低下の要因となるためである³¹⁾。また、商業生産においては、力価に加えて大規模培養での堅牢性、生成物耐性、遺伝的安定性といった特性も求められる^31,32)。このような多目的最適化問題や遺伝的要因の特定が困難な場合に帰納法的アプローチは非常に強力なツールとなる。その代表例が、ランダム変異導入による遺伝的多様性の創出と目的の形質を有する株の選抜を繰り返す微生物育種である。代表的な手法としては、特定環境下で長期的に培養し適応株を取得する適応進化（最近では Adaptive Laboratory Evolution：ALE と呼ばれている）や、 UV 照射・ EMS などの化学変異剤によるランダム変異導入が挙げられる。ALEは生物の自然変異を利用し、特定の環境下において継代培養し続けることで、環境に適応した菌異株を取得する方法であり、変異の偏りが少ないことから表現型の多様性を担保することができる育種手法である³³⁾。本手法は生成物耐性や生育に結びついた形質の改良には有効であるが、目的形質と増殖がカップリングしている必要がある。また変異導入が自然変異に依存し、改良に時間を要するため、変異体獲得までの時間を短縮することを目的に後述のUV照射やEMSなどの変異導入法と組み合わせこともある³⁴⁾。ランダム変異導入法においては、 UV 照射や化学変異剤が広く用いられているが、これらの変異導入法では塩基置換の偏りや挿入、欠失の頻度などに偏りが生じるため、自然変異で取得可能な表現型が出現しない可能性がある³⁵⁾。近年では、 CRISPR ライブラリにより特定遺伝子群を網羅的にノックアウトする手法も開発されているが、標的依存である点で完全なランダム性とは異なり、表現型の多様性に制限がある³⁶⁾。このような課題に対し、自然変異に近い変異スペクトラムで変異を導入することで、表現型の多様性を担保しながら、短期間で変異株を獲得するための変異導入技術が開発されている。例えば、当社が開発した不均衡変異導入法は、ミューテーターと呼ばれる複製精度が低下した DNA ポリメラーゼを遺伝子組換えにより一過的に発現させ、 DNA 複製過程におけるエラー導入を人為的に誘導することで、自然突然変異に近い広い変異スペクトラムを実現する手法である^37-39)（図1）。本手法では、従来法では取得が困難であった形質を比較的短期間で獲得することが可能であり、高い変異率と表現型多様性を両立できる点に特徴がある^37,40)。不均衡変異導入法は遺伝子組換えが必須であったが、近年遺伝子組み換えを伴わず同様の変異特性により変異導入が可能な変異導入技術も当社で開発されている。
　上記の帰納法的アプローチは多様化と選抜の工程を繰り返すことで最適化を図る手法であり、大規模なライブラリから目的とする微生物株を効率的に取得するためにはハイスループットな評価系の構築が不可欠である。ハイスループットな評価系として一般に、各クローンの活性を個別に測定する「スクリーニング」と酵素活性を宿主の増殖や生存と連動させて選抜する「セレクション」に大別される。スクリーニングは、呈色反応や蛍光検出、指示薬、特定の化合物に応答するバイオセンサーなどを用いて目的物質や中間体を定量的に評価できる点で柔軟性が高い一方、評価可能なライブラリサイズが培養可能なサンプル数で制約される⁴¹⁾。これに対しセレクションは、増殖速度などを指標として大規模ライブラリから一括で選抜可能であるが、付与する表現型を生存や増殖に結びつける系の設計が必要となり柔軟性に欠ける。いずれの手法においても、評価指標が目的物質の生成量や代謝フラックスと適切に相関すること、十分なダイナミックレンジを有すること、偽陽性・偽陰性を抑制できることが重要である。さらに重要なのは、評価系が実際の生産環境を適切に反映していることである。特に微生物育種において改良された微生物は、育種を実施した環境に適応するため、フラスコ培養における育種によって獲得した形質がスケールアップした培養条件において再現しないことがある⁴²⁾。したがって、培養条件やスケール差を考慮した評価系の構築が、商業生産を見据えた大規模培養における代謝経路最適化や堅牢性向上、ひいては生産性向上上に必要不可欠である。

1.5　おわりに

　精密発酵における菌株開発は、代謝系を可能な限り理解し、その理解に基づいて合理的に設計するという演繹的アプローチが取られていることが多い。しかし、実際の細胞内代謝は多層的つ動的な制御を受ける複雑系であり、その挙動を完全に理解して設計に落とし込むことは現実的には困難である。このため、「十分に理解して設計する」という演繹的アプローチだけでなく、「理解しきれない部分を含めて実験的に最適化する」帰納法的アプローチが不可欠である。本節で述べた各種手法は、このような前提のもとで、演繹的設計と帰納法的最適化をどのように組み合わせるかという観点から整理したものである。本稿が、菌株開発の実践的なアプローチの理解の一助となれば幸いである。

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